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绿原酸清除活性氧和抗脂质过氧化的研究
[ 来源:云南萄京生物化工科技发展有限公司   发布日期:2013-11-21 16:36:27  责任编辑:胡宗福,于文利,赵亚平半  浏览次 ]

(上海交通大学化学与化工学院,上海200240)

摘要:采用化学发光法,研究了不同浓度的绿原酸溶液对3种活性氧(Reactive Oxygen Species)05·、·OH和H202的清除和抗脂质过氧化能力。研究表明,绿原酸对三种活性氧均有清除作用,其清除能力与浓度呈剂量关系,还与所清除的自由基种类有关系。绿原酸溶液浓度较大时,对三种活性氧的清除效果均明显而且稳定,而浓度较低时,对Oi·和·OH清除效果则不理想,甚至产生一定的促氧化作用。同样,绿原酸对脂质过氧化也有明显的抑制作用,抑制效果也与浓度呈剂量关系。

关键词:绿原酸;自由基;脂质过氧化;化学发光法

 

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1002.6630(2006)02—0128.03

 

生物体系中包含有大量的脂质过氧化和自由基反应。正常情况下,生物体内自由基的产生和清除呈平衡状态,失去平衡时,在机体内可造成多种功能行障碍与疾病的发生。脂质过氧化严重破坏细胞膜的脂质结构中的脂肪酸,使膜酶损伤导致细胞功能障碍。研究发现,肿瘤、化学中毒、感染、炎症反应、自身免疫病、辐射损伤、血管疾病、癌症、衰老、DNA损伤等生理过程与二者有密切联系。

绿原酸(Chlorogenic acid)是我国传统中药金银花、杜仲叶的主要有效成分,也存在于葵花籽、水果、蔬菜、大豆、小麦、咖啡豆中。研究表明,绿原酸具有清热解毒、消炎利胆、抗菌、降血脂等生理功能。还有抗肿瘤、抑制突变等作用⋯。虽然其作用机理至今尚不十分清楚,但是大多认为与绿原酸能够清除自由基有一定关系。因此,本文用化学发光法对不同浓度的绿原酸在清除氧自由基和抗脂质过氧化方面进行了研究。


1 材料与方法

1.1 仪器

SHG—D型生物化学发光测量仪上海计量局实验工厂。


1. 2 试剂

95%绿原酸广东中大亿达洲生物科技股份有限公司;邻苯三酚(Parogallo) 北京化学药品有限公司;鲁米诺(1umin01)、邻菲哕啉(1,10~phenanthroline)

Sigma化学药品公司;CuCl(分析纯)、NaOH(分析纯)、乙醇(分析纯)、30%双氧水、HCI(分析纯) 上海试li一-f一;碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(实验室制备)。


1.3 方法

不同浓度的绿原酸溶液与三种活性氧和脂质过氧化的发生体系反应,所得的发光强度与空白时作比较(发光值降低程度越大,说明清除活性氧或抗脂质过氧化能力越强;反之,降低程度越小,说明能力越弱),从而说明其清除自由基和抗脂质过氧化的能力。


1.3.1 清除O2-·能力的检测(在6个样品管中分别加入100 u1的乙醇(作空白实验)和浓度不同的待测样品的乙醇溶液,然后均加入100u1 lmmol/L的邻苯三酚溶液、100 u1 lmmol/L的鲁米诺溶液(配置时,先用2~3滴稀氢氧化钠溶解),再加入碳酸盐缓冲溶液(pH=10.28),使反应总体积为lml。放入样品池,立即开始测定。


1.3.2 清除·OH能力的检测

在6个样品管中分别加入100ul的乙醇(作空白实验)和浓度不同的待测样品的乙醇溶液,然后均加入100u13mmol/L的邻菲罗啉溶液(配置时,先用2~3滴稀盐酸溶鳃)、100ul 2mmol/L的CuCl溶液(配置时,先用2~3滴稀盐酸溶解)和100 u 1 0.6%的双氧水,再加入磷酸盐缓冲溶液(pH7.38),使反应总体积为1ml。放入样品池,立即开始测定。


1.3.3 清除H2O2能力的检测

在6个样品管中分别加入100p1的乙醇(作空白实验)和浓度不同的待测样品的乙醇溶液,然后均加入100 ul  30%的双氧水、100 ul lmmol/L的鲁米诺溶液,再加入磷酸盐缓冲溶液(pH7.38),使反应总体积为1ml。放入样品池,立即开始测定。


1.3.4 抗脂质过氧化能力的检测

此方法的原理是利用羟基自由基的发生体系产生·OH,作为起动脂质过氧化反应的引发剂,产生脂过氧自由基作为体系的发光剂。发光强度的大小代表了反应生成LOO·的多少,从而可以看出脂质过氧化进行的程度。

在6个样品管中分别加入100u1的乙醇(作空白实验)和浓度不同的待测样品的乙醇溶液,然后均加入100 u1月见草油、100 u1 1 2mmol/L的CuCl溶液、100u1  0.6%的双氧水,再加入磷酸盐缓冲溶液(pH7.38),使反应总体积为1m1。摇匀后,放入样品池,立即开始测定。


2 结果与分析

在一开始的一段时间内,绿原酸液浓度大于等于0.02mg/ml时,发光强度较空白值有明显的降低,即对0j·有明显的清除作用,而且清除程度与绿原酸溶液的浓度呈线性量效关系;而浓度小于0.02mg/ml时,对发光值强度的抑制作用不明显,浓度为0.005mg/ml时甚至使发光值升高,即浓度较低时,清除作用减弱甚至产生促氧化作用。还可以看到,随着时间的延长,所有溶液的发光强度值都很快降低到很小,这是O2-·的寿命非常短,O2-·浓度迅速降低的原因。


2.2 对·0H的清除作用

只有绿原酸浓度为0.1mg/ml时才能对·OH产生明显且稳定的清除作用。而浓度小于0.1mg/ml时清除效果则不理想,在一定时间内甚至产生促氧化作用。至于出现“波峰、波谷”现象,可能是低浓度的绿原酸,在·OH

浓度较小时促进·OH的产生,·OH浓度达到一定程度时,又对其产生清除作用,如此反复,便产生此现象。对此过程的作用机理还有待于进一步研究。


2.3 对H202的清除作用

在体系中加入不同浓度绿原酸溶液时,其发光强度较空白溶液均有明显的降低,而且降低的程度与浓度大小的关系不大。结合表1不同浓度绿原酸对过氧化氢在2200s内的最大清除率,说明绿原酸溶液对活性氧H:Oz的清除能力非常强,0.1mg/ml的最大清除率达到95.43%,即使浓度为0.005mg/ml时,最大清除率也达到76.26%,清除效果依然非常好。


2.4 对脂质过氧化的抑制作用

绿原酸溶液有明显的抑制脂质过氧化作用,而且抑制程度与浓度呈剂量关系。随着时间的推移,大约352S后,浓度为0.005mg/ml的绿原酸液的发光值已与空白溶液接近,说明抗脂质过氧化作用不再明显。最后,所有浓度的发光值趋于接近,这是脂质过氧化反应已经趋于停止的原因。

从结构上看,绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸缩合而成的酯,属于酚类化合物。由于分子具有邻二酚羟基,因此具有极强的还原性而更易被自由基氧化I刚,从而表现出很好的自由基清除作用和抗脂质过氧化作用。


3 结论

绿原酸对三种活性氧均有清除作用,其清除作用与浓度呈剂量关系,还与所清除的自由基种类有关系。绿原酸溶液浓度较大时,对三种活性氧的清除效果均明显而且稳定,其中0.1mg/ml的绿原酸溶液对过氧化氢的最大清除率达到95.43%;而浓度较低时,对O2-·和·OH清除效果则变差,甚至产生一定的促氧化作用。绿原酸也是很好的预防性抗氧化剂,可以有效清除起动脂质过氧化的引发剂,从而起到抑制脂质过氧化的作用,其抑制程度也与浓度呈剂量关系。

 

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